|
|
Structural studies of selected protein complexes involved in signal transduction
Honzejková, Karolína ; Obšil, Tomáš (vedoucí práce) ; Bouřa, Evžen (oponent) ; Pavlíček, Jiří (oponent)
Protein-proteinové interakce jsou klíčové pro většinu fyziologických i patofyziologických dějů. Detailní charakterizace těchto interakcí je proto nezbytná nejen k porozumění podstaty těchto dějů, ale i pro návrh strategií, jak tyto interakce cíleně ovlivňovat. Tato práce se zaměřuje na studium struktury a interakcí několika proteinů a jejich komplexů. ASK1 (z anglického "apoptosis signal-regulating kinase 1") je mitogeny aktivovaná proteinkinasa kinasa kinasa (MAP3K), která aktivuje dráhy proteinkinas p38/JNK, čímž směruje buňky k zánětlivé reakci nebo apoptóze. ASK1 interaguje s thioredoxinem (TRX), malou dithioloxidoreduktasou, která inhibuje ASK1, nicméně mechanismus této inhibice je nejasný. CaMKK1 a CaMKK2 jsou Ca2+ /kalmodulin (CaM)- dependentní proteinkinasy, které regulují např. energetickou rovnováhu buňky, paměť či zánět. Obě jsou inhibovány proteiny 14-3-3, ale navzdory svým doménovým a sekvenčním podobnostem je rozsah inhibice zprostředkovaný proteiny 14-3-3 odlišný. Estrogenový receptor alfa (ERα) je jaderný receptor, který se podílí na vzniku rakoviny prsu. Pro léčbu tohoto onemocnění se používá tamoxifen, antagonista ERα, který však často způsobuje vznik rezistence. Proteiny 14-3-3 interagují s ERα a inhibují jeho transkripční aktivitu, povaha této interakce je však stále nejasná....
|
|
|
Vliv proteinu 14-3-3 na intradoménové interakce ubiktivin ligasy Nedd4-2
Pohl, Pavel ; Obšilová, Veronika (vedoucí práce) ; Žáková, Lenka (oponent) ; Pavlíček, Jiří (oponent)
CZ Lidská ubikvitin ligasa Nedd4-2 (NEDD4L) ubikvitinuje široké spektrum membránových proteinů a receptorů a hraje tak klíčovou roli v udržování homeostázy organismu. Tento enzym je regulován fosforylací a následnou interakcí s proteiny 14-3-3, čímž je primárně ovlivněna schopnost proteinu Nedd4-2 interagovat s různými substráty. Jen velmi málo je však známo o molekulární podstatě této protein-proteinové interakce. V této práci jsme se zaměřili na biofyzikální charakterizaci úlohy jednotlivých fosforylačních míst a mapování strukturních změn Nedd4-2 způsobených vazbou proteinů 14-3-3. Naše experimenty za užití metod analytické ultracentrifugace odhalily, že k stabilní vazbě proteinu Nedd4-2 na proteiny 14-3-3 je zapotřebí primárně dvou fosforylačních míst Ser342 a Ser448 . Krystalová struktura komplexu 14-3-3ηΔC:Nedd4-2335-455 T367A poté odhalila simultánní vazbu obou fosforylovaných reziduí do vazebného žlábku proteinu 14-3-3. Modelování na základě dat z maloúhlového rozptylu rentgenového záření a chemického zesítění spojeného s hmotnostní spektrometrií nastínilo rozsáhlé strukturní změny v oblasti jednotlivých domén proteinu Nedd4-2. Vazba proteinu 14-3-3η blokuje doménu WW3 proteinu Nedd4-2 v centrálním kanálu proteinu 14-3-3 a zároveň mění vzájemné pozice domén WW2 a WW4. WW domény Nedd4-2 jsou...
|
|
|
Structural studies of 14-3-3 protein complexes and their stabilization by small molecule compounds
Lentini Santo, Domenico ; Obšil, Tomáš (vedoucí práce) ; Brynda, Jiří (oponent) ; Pavlíček, Jiří (oponent)
Protein-proteinové interakce (PPI) hrají klíčovou roli téměř ve všech biologických procesech. Mnoho proteinů vyžaduje pro své fungování dynamické interakce s dalšími proteiny či biomolekulami. Proteomické studie naznačily, že lidský proteinový interaktom zahrnuje několika set tisíc proteinových komplexů. Detailní charakterizace PPI je proto nezbytná pro plné pochopení procesů zprostředkovaných proteinovými komplexy. Mnoho PPI je také zapojeno do procesů spojených s přenosem signálu (signálních drah) v rámci řady patologických stavů a tyto PPI představují důležité cíle pro vývoj nových léků, zejména v situacích, kdy nelze použít běžnější strategie, např. obsazení aktivního místa enzymu či vazebné místo receptoru. Tato disertační práce se zaměřuje na proteiny 14-3-3, rodinu adaptorových proteinů účastnících se regulace mnoha signálních drah. 14-3-3 proteiny fungují jako tzv. interakční uzly a kritické regulátory mnoha enzymů, receptorů a strukturních proteinů. Hlavním cílem této práce bylo strukturně charakterizovat vybrané komplexy proteinů 14-3-3 a zkoumat možnost jejich stabilizace nízkomolekulárními látkami. Pomocí kombinace proteinové krystalografie, diferenční skenovací fluorimetrie, fluorescenční polarizace a analytické ultracentrifugace byly studovány PPI mezi proteiny 14-3-3 a jejich dvěma...
|
|
|
Fyziologické úlohy Na+/H+ antiporterů v kvasinkách
Zahrádka, Jaromír
3 Abstrakt Kvasinky Saccharomyces cerevisiae patří k důležitým modelům při studiu homeostase iontů alkalických kovů. Stejně jako v jiných buňkách je pro S. cerevisiae nezbytné udržení určité koncentrace K+ uvnitř buněk, na druhou stranu Na+ a další ionty alkalických kovů jsou pro buňky toxické. K+ je akumulován pomocí uniporterů Trk1 a Trk2, zatímco export toxických iontů alkalických kovů, a také nadbytečného K+ , je zajištěn ATPasami Ena, Na+ (K+ )/H+ antiporterem Nha1 a K+ selektivním kanálem Tok1. Ačkoli jsou jednotlivé transportery poměrně dobře prozkoumány, není dosud mnoho známo o celkové regulaci homeostase iontů alkalických kovů ani o vzájemné interakci a regulaci mezi jednotlivými transportery. V rámci této práce byl studován antiporter Nha1 a jeho fyziologické úlohy v kontextu ostatních transporterů iontů alkalických kovů. Ukázalo se, že nejen Nha1p, ale také další exportery, ATPasy Ena a kanál Tok1, jsou, přes jejich výraznou odlišnost v mechanismu transportu i způsobu regulace, regulovány společně změnou aktivity importerů K+ a to prostřednictví membránového potenciálu. Vzájemná regulace a funkční propojení importerů a exporterů K+ , ale také další výsledky poprvé ukázaly, jak velice důležitá je neustálá cirkulace K+ , tedy současný vstup a výstup K+ , pro udržování homeostase iontů alkalických...
|
|
|
Mechanismus regulace funkce fosducinu
Kacířová, Miroslava
Předkládaná disertační práce volně navazuje na mou práci diplomovou. Zabývá se studiem 30kDa proteinu fosducinu (Pdc) a mechanismem regulace jeho funkce prostřednictvím vazby s 28kDa adaptorovým proteinem 14-3-3. Oba tyto proteiny se účastní signální dráhy spojené s G-proteiny, především v procesu vidění. Pdc váže komplex βγ podjednotek heterotrimerního G-proteinu transducinu (Gtβγ) a tím brání zpětné reasociaci Gtβγ s podjednotkou Gtα, čímž blokuje přenos světelného signálu. Tento proces se pravděpodobně uplatňuje při dlouhodobé adaptaci na změnu intenzity světla. Regulační funkce Pdc je dále regulována jeho fosforylací a následnou vazbou na protein 14-3-3. Na základě dostupných dat bylo spekulováno, že vazba 14-3-3 je klíčová pro inhibici interakce mezi fosforylovaným Pdc (Pdc-PP) a Gtβγ. Vznik komplexu 14-3-3/Pdc-PP pak vede k reasociaci trimerního transducinu a zesílení přenosu světelného signálu. Mechanismus, jakým protein 14-3-3 inhibuje interakci Pdc s Gtβγ, je však stále neznámý. Cílem této disertační práce bylo objasnit strukturu volného Pdc a jeho komplexu s proteinem 14-3-3 a s pomocí získaných dat navrhnout mechanismus regulace funkce Pdc. Struktura Pdc a komplexu 14-3-3/Pdc-PP byla studována celou řadou biofyzikálních metod včetně maloúhlového rozptylu rentgenového záření (SAXS), NMR,...
|
|
|
Mechanismus regulace funkce fosducinu
Kacířová, Miroslava
Předkládaná disertační práce volně navazuje na mou práci diplomovou. Zabývá se studiem 30kDa proteinu fosducinu (Pdc) a mechanismem regulace jeho funkce prostřednictvím vazby s 28kDa adaptorovým proteinem 14-3-3. Oba tyto proteiny se účastní signální dráhy spojené s G-proteiny, především v procesu vidění. Pdc váže komplex βγ podjednotek heterotrimerního G-proteinu transducinu (Gtβγ) a tím brání zpětné reasociaci Gtβγ s podjednotkou Gtα, čímž blokuje přenos světelného signálu. Tento proces se pravděpodobně uplatňuje při dlouhodobé adaptaci na změnu intenzity světla. Regulační funkce Pdc je dále regulována jeho fosforylací a následnou vazbou na protein 14-3-3. Na základě dostupných dat bylo spekulováno, že vazba 14-3-3 je klíčová pro inhibici interakce mezi fosforylovaným Pdc (Pdc-PP) a Gtβγ. Vznik komplexu 14-3-3/Pdc-PP pak vede k reasociaci trimerního transducinu a zesílení přenosu světelného signálu. Mechanismus, jakým protein 14-3-3 inhibuje interakci Pdc s Gtβγ, je však stále neznámý. Cílem této disertační práce bylo objasnit strukturu volného Pdc a jeho komplexu s proteinem 14-3-3 a s pomocí získaných dat navrhnout mechanismus regulace funkce Pdc. Struktura Pdc a komplexu 14-3-3/Pdc-PP byla studována celou řadou biofyzikálních metod včetně maloúhlového rozptylu rentgenového záření (SAXS), NMR,...
|
|
|
Úloha protein-proteinových interakcí v regulaci signálních proteinů a enzymů
Košek, Dalibor ; Obšil, Tomáš (vedoucí práce) ; Karpenko, Vladimír (oponent) ; Pompach, Petr (oponent)
CZ Mezi všemi způsoby regulace signalizace mají protein-proteinové interakce přednostní postavení. Jejich studium v různých podmínkách je logickým a důležitým krokem v pochopení molekulárního mechanismu funkcí jednotlivých regulačních procesů. Tato práce je zaměřena na studium tří takových procesů: ASK1 proteinkinasa, důležitý iniciátor proapoptotických dějů, je za fyziologických podmínek udržována v neaktivním stavu v komplexu s proteinem 14-3-3 a TRX1. Za podmínek oxidačního stresu však tyto proteiny disociují a proteinkinasa se stává aktivní. Dalším procesem je interakce proteinu 14-3-3 s fosducinem a studium jeho úlohy v negativní regulaci G proteinové signalizace v rámci biochemie zraku. Třetí proces je aktivace Nth1 prostřednictvím interakce s Bmh1 a vápníkových kationů. Práce si klade za cíl pomocí různých biochemických a biofyzikálních metod, zejména bodové mutageneze, analytické ultracentrifugace, maloúhlového rozptylu rentgenového záření a fluorescenční spektroskopie přispět k objasnění strukturní podstaty výše popsaných dějů a vysvětlit úlohu protein-proteinových interakcí v jejich regulaci. Na základě výsledků získaných těmito metodami byly zjištěny strukturní informace o tvaru a stechiometrii komplexů TRX1 i proteinu 14-3-3 s odpovídajícími vazebnými doménami ASK1 včetně jejich...
|
|
|
Crosstalk of PKN3 and p130Cas/BCAR1 signaling
Dibus, Michal ; Rösel, Daniel (vedoucí práce) ; Voller, Jiří (oponent)
Ako p130Cas, tak PKN3, sú dôležitými regulátormi bunkovej signalizácie, ktorej deregulácia vedie k malignému rastu nádorových buniek. Nedávno sme v našom laboratóriu zistili, že prostredníctvom SH3 domény p130Cas dochádza k interacii s polyprolínovým motívom PKN3, naznačujúc ich potenciálnu úlohu v spoločnej regulácii týchto procesov. V rámci tejto práce sme sa zamerali na fosforyláciu p130Cas kinázou PKN3 a potvrdili sme, že serín 498 (S498) vyskytujúci sa v SRD p130Cas je PKN3 fosforylovaný in vitro. Vzhľadom k tomu, že S498 sa nachádza vo väzbovom motíve pre proteíny 14-3-3 a jeho fosforylácia je pre interakciu p130Cas so 14-3-3 vyžadovaná, navrhli sme potenciálne novú signálnu dráhu, a to PKN3/p130Cas/14-3-3. V druhej časti práce sme študovali odpoveď tejto dráhy na pôsobenie antiestrogénov v nádorových bunkách línie MCF7, pozitívnych na estrogénové receptory. Napriek tomu, že sme ukázali, že v rámci skorej odpovede na pôsobenie tamoxifénu dochádza k inaktivácii PKN3, nevylučujeme jej neskoršiu úlohu v procese vzniku antiestrogénovej rezistencie. Navyše, objasnenie signalizácie stimulovanej interakciou p130Cas s PKN3 a jej možného vplyvu na maligný rast nádorových buniek by mohlo prispieť k návrhu nových terapeutických cieľov.
|
|
|
Mechanismus regulace funkce fosducinu
Kacířová, Miroslava ; Obšil, Tomáš (vedoucí práce) ; Krůšek, Jan (oponent) ; Pavlíček, Jiří (oponent)
Předkládaná disertační práce volně navazuje na mou práci diplomovou. Zabývá se studiem 30kDa proteinu fosducinu (Pdc) a mechanismem regulace jeho funkce prostřednictvím vazby s 28kDa adaptorovým proteinem 14-3-3. Oba tyto proteiny se účastní signální dráhy spojené s G-proteiny, především v procesu vidění. Pdc váže komplex βγ podjednotek heterotrimerního G-proteinu transducinu (Gtβγ) a tím brání zpětné reasociaci Gtβγ s podjednotkou Gtα, čímž blokuje přenos světelného signálu. Tento proces se pravděpodobně uplatňuje při dlouhodobé adaptaci na změnu intenzity světla. Regulační funkce Pdc je dále regulována jeho fosforylací a následnou vazbou na protein 14-3-3. Na základě dostupných dat bylo spekulováno, že vazba 14-3-3 je klíčová pro inhibici interakce mezi fosforylovaným Pdc (Pdc-PP) a Gtβγ. Vznik komplexu 14-3-3/Pdc-PP pak vede k reasociaci trimerního transducinu a zesílení přenosu světelného signálu. Mechanismus, jakým protein 14-3-3 inhibuje interakci Pdc s Gtβγ, je však stále neznámý. Cílem této disertační práce bylo objasnit strukturu volného Pdc a jeho komplexu s proteinem 14-3-3 a s pomocí získaných dat navrhnout mechanismus regulace funkce Pdc. Struktura Pdc a komplexu 14-3-3/Pdc-PP byla studována celou řadou biofyzikálních metod včetně maloúhlového rozptylu rentgenového záření (SAXS), NMR,...
|
|
|
Studium interakce forkhead transkripčního faktoru FOXO4 s DNA a s proteinem 14-3-3
Vácha, Petr ; Obšil, Tomáš (vedoucí práce) ; Pavlíček, Jiří (oponent) ; Krůšek, Jan (oponent)
UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA Katedra fyzikální a makromolekulární chemie Autoreferát doktorské práce Studium interakce forkhead transkripčního faktoru FOXO4 s DNA a s proteinem 14-3-3 RNDr. Petr Vácha Školitel: Prof. RNDr. Tomáš Obšil, Ph.D. Praha 2015 Abstrakt Tato doktorská práce se zabývá studiem interakcí lidského forkhead transkripčního faktoru FOXO4 s DNA a s regulačním proteinem 14-3-3. Hlavním cílem této práce byla detailní charakterizace interakce DNA-vazebné domény proteinu FOXO4 se dvěmi kanonickými sekvencemi DNA a dále objasnění úlohy proteinu 14-3-3 v procesu regulace funkce FOXO4. Transkripční faktory FOXO jsou účinnými aktivátory transkripce genů, čímž ovlivňují celou řadu buněčných procesů. Protein FOXO4 patří do rodiny forkhead transkripčních faktorů, což je skupina několika desítek proteinů, jejichž společným znakem je velmi konzervovaná DNA-vazebná doména. Podstata DNA-vazebné specifity těchto proteinů, tedy co přesně determinuje drobné odlišnosti ve vazebných vlastnostech jednotlivých forkhead proteinů, je i přes množství dostupných strukturních dat stále nejasné. Proto byla provedena detailní charakterizace interakcí mezi DNA-vazebnou doménou proteinu FOXO4 a DNA pomocí rezonance povrchového plazmonu (SPR) a časově- rozlišené fluorescenční spektroskopie. Výsledky...
|
host ::
RSS.